हिस्टोलॉजिकल परीक्षा एक माइक्रोस्कोप के तहत ऊतक की जांच है। एक साइटोलॉजिकल परीक्षा हिस्टोलॉजिकल परीक्षा से भिन्न होती है जिसमें यह ऊतक की जांच नहीं करती है, बल्कि कोशिकाओं की जांच करती है।

माइक्रोस्कोपी के प्रकार

प्रकाश माइक्रोस्कोपी विधियाँ
प्रकाश माइक्रोस्कोपी विधियाँ (रोशनी और अवलोकन)। अध्ययन की जा रही वस्तुओं की प्रकृति और गुणों के आधार पर माइक्रोस्कोपी विधियों का चयन किया जाता है (और रचनात्मक रूप से प्रदान किया जाता है), क्योंकि बाद वाला, जैसा कि ऊपर बताया गया है, छवि कंट्रास्ट को प्रभावित करता है।

उज्ज्वल क्षेत्र विधि एवं उसकी किस्में
संचरित प्रकाश में उज्ज्वल क्षेत्र विधि का उपयोग अवशोषित (प्रकाश-अवशोषित) कणों और उनमें शामिल भागों के साथ पारदर्शी तैयारी का अध्ययन करने के लिए किया जाता है। यह, उदाहरण के लिए, जानवरों और पौधों के ऊतकों के पतले रंग वाले खंड, खनिजों के पतले खंड आदि हो सकते हैं।

डार्क फील्ड विधि और इसकी विविधताएँ
एक विशेष कंडेनसर का उपयोग किया जाता है जो बिना रंग वाली सामग्री की विपरीत संरचनाओं को उजागर करता है। इस मामले में, प्रकाशक की किरणें एक तिरछे कोण पर तैयारी पर पड़ती हैं, और अध्ययन की वस्तु एक अंधेरे क्षेत्र में प्रकाशित दिखाई देती है।

चरण विपरीत विधि
जब प्रकाश चित्रित वस्तुओं से होकर गुजरता है, तो प्रकाश तरंग का आयाम बदल जाता है, और जब प्रकाश अप्रकाशित वस्तुओं से गुजरता है, तो प्रकाश तरंग का चरण बदल जाता है, जिसका उपयोग उच्च-विपरीत छवि प्राप्त करने के लिए किया जाता है।

ध्रुवीकरण माइक्रोस्कोपी
ध्रुवीकरण माइक्रोस्कोपी अनिसोट्रॉपी और/या बाइरफ़्रिंगेंस के विश्लेषण के आधार पर ऊतक घटकों के अल्ट्रास्ट्रक्चरल संगठन का अध्ययन करना संभव बनाता है

हस्तक्षेप विपरीत विधि
इंटरफेरेंस कंट्रास्ट विधि (इंटरफेरेंस माइक्रोस्कोपी) में माइक्रोस्कोप में प्रवेश करते ही प्रत्येक किरण को विभाजित करना शामिल है। परिणामी किरणों में से एक को प्रेक्षित कण के माध्यम से निर्देशित किया जाता है, दूसरा - माइक्रोस्कोप की उसी या अतिरिक्त ऑप्टिकल शाखा के साथ इसे पार करता है। माइक्रोस्कोप के ऐपिस भाग में, दोनों किरणें फिर से जुड़ी हुई हैं और एक दूसरे के साथ हस्तक्षेप करती हैं। वस्तु से गुजरने वाली किरणों में से एक, चरण में विलंबित होती है (दूसरी किरण की तुलना में पथ अंतर प्राप्त कर लेती है)। इस देरी की भयावहता को एक क्षतिपूर्तिकर्ता द्वारा मापा जाता है

ल्यूमिनसेंस प्रकाश में अनुसंधान विधि
ल्यूमिनसेंस (ल्यूमिनेसेंस माइक्रोस्कोपी, या फ्लोरोसेंस माइक्रोस्कोपी) के प्रकाश में अनुसंधान विधि में माइक्रोस्कोप के तहत माइक्रोऑब्जेक्ट्स की हरी-नारंगी चमक का अवलोकन करना शामिल है, जो तब होता है जब वे नीले-बैंगनी प्रकाश या आंखों के लिए अदृश्य पराबैंगनी किरणों से प्रकाशित होते हैं।

पराबैंगनी माइक्रोस्कोपी. यह 380 एनएम से कम तरंग दैर्ध्य वाली पराबैंगनी किरणों के उपयोग पर आधारित है, जो लेंस के रिज़ॉल्यूशन को 0.2...0.3 माइक्रोन से 0.11 माइक्रोन तक बढ़ाने की अनुमति देता है। विशेष पराबैंगनी सूक्ष्मदर्शी के उपयोग की आवश्यकता होती है, जो पराबैंगनी प्रकाशकों, क्वार्ट्ज ऑप्टिक्स और स्पेक्ट्रम के दृश्य भाग में पराबैंगनी किरणों के कन्वर्टर्स का उपयोग करते हैं। कई पदार्थ जो कोशिकाएं बनाते हैं (उदाहरण के लिए, न्यूक्लिक एसिड) पराबैंगनी किरणों को चुनिंदा रूप से अवशोषित करते हैं, जिसका उपयोग कोशिका में इन पदार्थों की मात्रा निर्धारित करने के लिए किया जाता है।

ट्रांसमिशन माइक्रोस्कोपी. ट्रांसमिशन माइक्रोस्कोप में, इलेक्ट्रॉन नमूने से होकर गुजरते हैं। इलेक्ट्रॉनों की ऊर्जा अपेक्षाकृत कम (50 kV तक) होती है; इस मामले में, वे नष्ट हो जाते हैं और अवशोषित हो जाते हैं। एक विपरीत छवि बनाने के लिए, सामग्री तैयार करने के विशेष तरीकों का उपयोग किया जाता है।

स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन सूक्ष्मदर्शीनमूने के स्कैन के आधार पर। इस मामले में, इलेक्ट्रॉनों की एक सटीक केंद्रित किरण नमूने की सतह पर चलती है, और परावर्तित इलेक्ट्रॉन त्रि-आयामी के समान एक छवि बनाते हैं। स्कैनिंग माइक्रोस्कोप का रिज़ॉल्यूशन ट्रांसमिशन माइक्रोस्कोप (5...20 एनएम) से कम होता है।

उच्च वोल्टेज इलेक्ट्रॉन सूक्ष्मदर्शीअति-उच्च ऊर्जा इलेक्ट्रॉनों (1 एमवी - एक मिलियन वोल्ट तक) के उपयोग पर आधारित हैं। ऐसी शक्तिशाली किरणें अपेक्षाकृत मोटे वर्गों (5 µm तक) में प्रवेश करती हैं, जिससे इस प्रकार की माइक्रोस्कोपी का उपयोग संपूर्ण कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है।

बर्फ़ीली विधि - टुकड़े करना।

कोशिकाओं को क्रायोप्रोटेक्टेंट की उपस्थिति में तरल नाइट्रोजन तापमान (196 डिग्री सेल्सियस) पर जमे हुए किया जाता है और चिप्स बनाने के लिए उपयोग किया जाता है। दरार तल लिपिड बाईलेयर के हाइड्रोफोबिक मध्य से होकर गुजरते हैं। झिल्लियों की उजागर आंतरिक सतह को प्लैटिनम से छायांकित किया जाता है, और परिणामी प्रतिकृतियों का स्कैनिंग ईएम में अध्ययन किया जाता है। फिर, आमतौर पर एक निर्वात कक्ष में, अतिरिक्त बर्फ को ऊर्ध्वपातन द्वारा हटा दिया जाता है। इस ऑपरेशन को कहा जाता है नक़्क़ाशी. नक़्क़ाशी के बाद, दरार तल में राहत अधिक स्पष्ट रूप से परिभाषित होती है। नमूना प्राप्त हुआ छायांकित, अर्थात्, नमूने की सतह पर भारी धातुओं की एक पतली परत छिड़की जाती है।

टिशू कल्चर, माइक्रोसर्जरी।

कोशिका एवं ऊतक संवर्धन विधि

इसमें शरीर के बाहर कृत्रिम पोषक माध्यम में बढ़ती कोशिकाएं और ऊतक शामिल हैं। यह विधि विभिन्न प्रभावों, प्रसार, विभेदन और मृत्यु के नियमन के तंत्रों के प्रति कोशिका प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करना संभव बनाती है।

माइक्रोसर्जरी(micrurgia; mikr + ergon - कार्य, क्रिया) - बहुत छोटी वस्तुओं पर संचालन करने के लिए पद्धतिगत तकनीकों और तकनीकी साधनों का एक सेट: एककोशिकीय जीव, व्यक्तिगत बहुकोशिकीय कोशिकाएं, इंट्रासेल्युलर संरचनाएं।

सेल इंजीनियरिंग, हेटेरोकेरियन की अवधारणा, संकरण।

हेटेरोकेरियन- आनुवंशिक रूप से भिन्न अगुणित नाभिकों के साथ मूल कोशिकाओं के संलयन के परिणामस्वरूप बनने वाली एक दैहिक कोशिका। परिणामी हेटेरोकेरियन दो मोनोन्यूक्लियर हाइब्रिड कोशिकाओं को जन्म देते हैं।

1965 में, अंग्रेजी वैज्ञानिक जी. हैरिस चूहों और मानव कोशिकाओं द्वारा निर्मित हेटेरोकेरियन्स प्राप्त करने वाले पहले व्यक्ति थे।

संकरण बनाने या प्राप्त करने की प्रक्रिया है संकर, जो एक कोशिका में विभिन्न कोशिकाओं की आनुवंशिक सामग्री के संयोजन पर आधारित है

ध्रुवीकरण माइक्रोस्कोपीआपको बिना दाग वाले अनिसोट्रोपिक संरचनाओं (उदाहरण के लिए, कोलेजन फाइबर, मायोफिब्रिल्स या माइक्रोबियल कोशिकाएं) की छवियां प्राप्त करने की अनुमति देता है। विधि का सिद्धांत परस्पर लंबवत विमानों में ध्रुवीकृत दो किरणों द्वारा निर्मित प्रकाश में किसी वस्तु का अध्ययन करने पर आधारित है।

हस्तक्षेप माइक्रोस्कोपी

हस्तक्षेप माइक्रोस्कोपीचरण-विपरीत और ध्रुवीकरण माइक्रोस्कोपी के सिद्धांतों को जोड़ती है। इस विधि का उपयोग अप्रकाशित वस्तुओं की एक विपरीत त्रि-आयामी छवि प्राप्त करने के लिए किया जाता है। विधि का सिद्धांत माइक्रोस्कोप में प्रकाश प्रवाह को विभाजित करने पर आधारित है; एक किरण वस्तु से होकर गुजरती है, दूसरी - उसके पार। दोनों किरणें ऐपिस पर जुड़ी हुई हैं और एक दूसरे के साथ हस्तक्षेप करती हैं।

प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी

प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी विधिशॉर्ट-वेव विकिरण के संपर्क में आने पर कुछ पदार्थों की चमकने की क्षमता पर आधारित। इस मामले में, उत्सर्जित प्रकाश तरंगें चमक पैदा करने वाली तरंग से अधिक लंबी होती हैं। दूसरे शब्दों में, फ्लोरोसेंट वस्तुएं एक तरंग दैर्ध्य के प्रकाश को अवशोषित करती हैं और स्पेक्ट्रम के दूसरे क्षेत्र में प्रकाश उत्सर्जित करती हैं (चित्र 11-4)। उदाहरण के लिए, यदि उत्प्रेरण विकिरण नीला है, तो परिणामी चमक लाल या पीली हो सकती है। इन पदार्थों (फ्लोरेसिन आइसोसाइनेट, एक्रिडीन ऑरेंज, रोडामाइन, आदि) का उपयोग फ्लोरोसेंट (ल्यूमिनसेंट) वस्तुओं के अवलोकन के लिए फ्लोरोसेंट रंगों के रूप में किया जाता है। प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप में, एक स्रोत (अति उच्च दबाव पारा लैंप) से प्रकाश दो फिल्टर से होकर गुजरता है।

पहला (नीला) फ़िल्टरनमूने के सामने प्रकाश को फँसाता है और तरंग दैर्ध्य के प्रकाश को संचारित करता है जो नमूने के प्रतिदीप्ति को उत्तेजित करता है। दूसरा (पीला) नीली रोशनी को रोकता है, लेकिन एक फ्लोरोसेंट वस्तु द्वारा उत्सर्जित और आंख द्वारा देखी जाने वाली पीली, लाल, हरी रोशनी को संचारित करता है। आमतौर पर, अध्ययन के तहत सूक्ष्मजीवों को सीधे या फ्लोरोक्रोम के साथ लेबल किए गए एटी या लेक्टिन का उपयोग करके दाग दिया जाता है। दवाएं एजी या वस्तु की अन्य लिगैंड-बाइंडिंग संरचनाओं के साथ परस्पर क्रिया करती हैं। प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपीअध्ययन की गई वस्तु के एजी के साथ फ्लोरोसेंट रंगों के साथ लेबल किए गए एटी की विशिष्ट बातचीत के आधार पर इम्यूनोकेमिकल प्रतिक्रियाओं के परिणामों को देखने के लिए व्यापक आवेदन मिला है। विकल्प इम्यूनोफ्लोरेसेंट प्रतिक्रियाएंचित्र में प्रस्तुत किए गए हैं। 11-5 और 11-6.

ध्रुवीकरण माइक्रोस्कोपी- रूपात्मक अनुसंधान के अत्यधिक प्रभावी तरीकों में से एक, जिसमें जैविक संरचनाओं की पहचान करने की व्यापक क्षमताएं हैं, जो पहुंच और सापेक्ष सादगी के साथ मिलकर इसका उच्च मूल्य निर्धारित करती हैं। यह विधि न केवल दवा की हिस्टोलॉजिकल संरचना, बल्कि इसके कुछ हिस्टोकेमिकल मापदंडों का भी अध्ययन करना संभव बनाती है। XX सदी के 40 और 50 के दशक में। ध्रुवीकरण माइक्रोस्कोपी को एक अल्ट्रास्ट्रक्चरल विधि माना जाता था, क्योंकि इससे ऊतकों की अल्ट्रास्ट्रक्चरल क्षमताओं को देखना संभव हो गया था।

ध्रुवीकरण माइक्रोस्कोपी को हिस्टोलॉजिकल संरचनाओं के गुणों का अध्ययन करने के लिए डिज़ाइन किया गया है जिसमें द्विअपवर्तन (एनिसोट्रॉपी) की क्षमता होती है - अनिसोट्रोपिक माध्यम से गुजरने पर प्रकाश किरण का विभाजन। अनिसोट्रोपिक माध्यम में एक प्रकाश तरंग विद्युत चुम्बकीय तरंगों के दोलन के परस्पर लंबवत विमानों के साथ दो तरंगों में टूट जाती है। इन तलों को ध्रुवण तल कहा जाता है। ध्रुवीकृत प्रकाश सामान्य (गैर-ध्रुवीकृत) प्रकाश से इस मायने में भिन्न होता है कि बाद वाले प्रकाश में प्रकाश तरंगें अलग-अलग तलों में दोलन करती हैं, जबकि ध्रुवीकृत प्रकाश में वे केवल एक निश्चित तल में होती हैं।

ध्रुवीकरण प्रभाव पैदा करने के लिए, एक ध्रुवीकरण माइक्रोस्कोप दो पोलेरॉइड का उपयोग करता है। पहला, जिसे पोलराइज़र कहा जाता है, माइक्रोस्कोप इल्यूमिनेटर और हिस्टोलॉजिकल नमूने के बीच रखा जाता है। दूसरा पोलेरॉइड, हिस्टोलॉजिकल नमूना और शोधकर्ता की आंख के बीच स्थित होता है, विश्लेषक होता है। ध्रुवीकरणकर्ता और विश्लेषक दोनों वैकल्पिक रूप से बिल्कुल एक ही ध्रुवीकरण फिल्टर हैं, इसलिए उन्हें स्वैप किया जा सकता है (यदि माइक्रोस्कोप का डिज़ाइन इसकी अनुमति देता है)। पहले, आइसलैंड स्पर से बने निकोलस, एरेन्स या थॉमसन प्रिज्म का उपयोग ध्रुवीकरण माइक्रोस्कोपी के लिए किया जाता था। इन प्रिज्मों में प्रकाश के अपवर्तन का कोण सीमित था। वर्तमान में, उनके स्थान पर, फ्लैट ध्रुवीकरण फिल्टर का उपयोग किया जाता है, जो विस्तृत-क्षेत्र ध्रुवीकृत प्रकाश उत्पन्न करते हैं।

ध्रुवीकृत प्रकाश बनाने में, माइक्रोस्कोप के ऑप्टिकल अक्ष के सापेक्ष ध्रुवीकरणकर्ता और विश्लेषक की सापेक्ष स्थिति द्वारा निर्धारण भूमिका निभाई जाती है। यदि वे इस तरह से उन्मुख हैं कि दोनों एक ही विमान में ध्रुवीकृत प्रकाश संचारित करते हैं, यानी। जब उनके ध्रुवीकरण के तल मेल खाते हैं, तो दोनों ध्रुवीकरण फिल्टर ध्रुवीकृत प्रकाश संचारित करने में सक्षम होते हैं; सूक्ष्मदर्शी का दृश्य क्षेत्र उज्ज्वल है (चित्र 1ए)।

चावल। मानव फेफड़े का 1 ब्राइटफील्ड नमूना, ओलंपससीएक्स41, 10x लेंस

यदि ध्रुवीकरण फिल्टर के ध्रुवीकरण विमान परस्पर लंबवत हैं (यह माइक्रोस्कोप के ऑप्टिकल अक्ष के चारों ओर विश्लेषक को 90 डिग्री घुमाकर प्राप्त किया जाता है), तो ध्रुवीकृत प्रकाश नहीं गुजरता है और शोधकर्ता को दृश्य का एक अंधेरा क्षेत्र दिखाई देता है (चित्र)। 2).

जब पोलराइज़र को घूमते हुए 360° घुमाया जाता है, तो देखने का क्षेत्र दो बार पूरी तरह से अंधेरा हो जाता है और दो बार पूरी तरह से उज्ज्वल हो जाता है। अतीत में, प्रतिपूरक बर्नॉयर फिल्टर का उपयोग किया गया है, जो दृश्य के अंधेरे क्षेत्र में लाल रंग का टिंट उत्पन्न करता है ( यू-टीपी530 ). जब काले दर्पण फिल्टर का उपयोग किया जाता है, तो दृश्य का अंधेरा क्षेत्र पूरी तरह से अंधेरा नहीं दिखता है, बल्कि हल्का रोशन होता है।

चित्र 2 ध्रुवीकृत प्रकाश में मानव फेफड़े का नमूना, 10x उद्देश्य

ऐसे मामलों में, जहां ध्रुवीकरण फिल्टर (यानी ऑर्थोस्कोपी में) की एक क्रॉस स्थिति के साथ, ध्रुवीकृत प्रकाश के पथ में हिस्टोलॉजिकल नमूने में निहित अनिसोट्रोपिक पदार्थ सामने आते हैं, ये पदार्थ प्रकाश के दोलन के परस्पर लंबवत विमानों के साथ ध्रुवीकृत प्रकाश को दो किरणों में विभाजित करते हैं लहर की। ध्रुवीकरण के विमान के साथ मेल खाने वाले कंपन के विमान वाली प्रकाश किरणें विश्लेषक से होकर गुजरती हैं, और लंबवत विमान वाली प्रकाश किरणें कट जाती हैं, जिसके परिणामस्वरूप शोधकर्ता की आंख और कैमरे पर प्रवेश करने वाले प्रकाश प्रवाह की तीव्रता केवल आधी होती है मूल प्रकाश किरण की तीव्रता. वर्णित प्रक्रियाओं के परिणामस्वरूप, दो पार किए गए ध्रुवीकरणकर्ताओं के बीच स्थित अनिसोट्रोपिक पदार्थ हल्के चमकदार वस्तुओं के रूप में एक अंधेरे पृष्ठभूमि के खिलाफ दिखाई देते हैं। साथ ही, आइसोट्रोपिक संरचनाएं जिनमें द्विअपवर्तन की क्षमता नहीं होती, वे अंधेरे में रहती हैं।

इसका असर चुनाव पर भी पड़ता है ध्रुवीकरण माइक्रोस्कोपी के लिए कैमरे. चूँकि कार्य एक गहरे रंग की पृष्ठभूमि पर छोटे उज्ज्वल संकेतों को कैप्चर करना है, आमतौर पर कैमरे की कम संवेदनशीलता और रिकॉर्डिंग के दौरान उत्पन्न होने वाले शोर की बड़ी मात्रा के कारण उज्ज्वल-क्षेत्र माइक्रोस्कोपी के लिए एक कैमरा पर्याप्त नहीं हो सकता है। ध्रुवीकरण माइक्रोस्कोपी के लिए उच्च संवेदनशीलता और सटीक रंग पुनरुत्पादन वाले माइक्रोस्कोपी कैमरे की आवश्यकता होती है. सीसीडी मैट्रिसेस (, वीजेड-सीसी50एस) पर आधारित कैमरों का उपयोग करना बेहतर है, हालांकि, वर्तमान चरण में, आप सोनी आईएमएक्स श्रृंखला सीएमओएस मैट्रिसेस () पर आधारित कैमरों के बजट संस्करण का भी उपयोग कर सकते हैं।

जैविक ऊतकों में पर्याप्त संख्या में अनिसोट्रोपिक संरचनाएं होती हैं: मांसपेशियों के संकुचन तंत्र के तत्व, अमाइलॉइड, यूरिक एसिड, कोलेजन संरचनाएं, कुछ लिपिड, कई क्रिस्टल आदि।

अनिसोट्रोपिक वस्तु में विभाजित होने वाली और विश्लेषक से गुजरने वाली प्रकाश किरणें असमान तरंग प्रसार गति की विशेषता होती हैं। इस अंतर के परिमाण के आधार पर (इसे भी कहा जाता है)। प्रकाश किरण का विलंब मान) और विश्लेषक में प्रकाश अवशोषण में अंतर के कारण, अनिसोट्रोपिक वस्तुओं की चमक सफेद या रंगीन हो सकती है। बाद के मामले में हम द्वैतवाद की घटना के बारे में बात कर रहे हैं ( दोहरा अवशोषणमैं)। जब एक ध्रुवीकृत क्षेत्र में अध्ययन किया जाता है, तो रंग प्रभाव उत्पन्न होता है, उदाहरण के लिए, कई क्रिस्टल द्वारा।

द्विअपवर्तन की प्रक्रिया को कुछ रंगों के उपयोग से बढ़ाया जा सकता है, जिनके अणुओं में अनिसोट्रोपिक संरचनाओं पर उन्मुख रूप से जमा होने की क्षमता होती है। हिस्टोकेमिकल प्रतिक्रियाएं जिनके परिणामस्वरूप अनिसोट्रॉपी प्रभाव होता है, उन्हें टोपो-ऑप्टिक प्रतिक्रियाएं (जी. रोम्हैनी) कहा जाता है। ऐसी प्रतिक्रियाएँ दो प्रकार की होती हैं - योगात्मक और व्युत्क्रम। योगात्मक प्रतिक्रियाओं के साथ, प्रकाश किरण की देरी बढ़ जाती है, जिसे सकारात्मक अनिसोट्रॉपी कहा जाता है; व्युत्क्रम प्रतिक्रियाओं के साथ, यह घट जाती है - नकारात्मक अनिसोट्रॉपी।

हार्डवेयर और उपकरण

ध्रुवीकरण माइक्रोस्कोपी विशेष ध्रुवीकरण सूक्ष्मदर्शी का उपयोग करके किया जाता है। उदाहरण के तौर पर, हम आयातित सूक्ष्मदर्शी का नाम ले सकते हैं। अधिकांश आधुनिक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप ध्रुवीकरण माइक्रोस्कोपी के लिए सहायक उपकरण से सुसज्जित हैं।

ध्रुवीकरण माइक्रोस्कोपी के लिए किसी भी प्रयोगशाला या अनुसंधान ग्रेड प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग किया जा सकता है। दो ध्रुवीकरण फिल्टर होना पर्याप्त है, जिनमें से एक, ध्रुवीकरणकर्ता के रूप में कार्य करते हुए, प्रकाश स्रोत और नमूने के बीच रखा जाता है, और दूसरा, जो विश्लेषक की भूमिका निभाता है, नमूने और शोधकर्ता की आंख के बीच रखा जाता है। पोलराइज़र को कंडेनसर में बनाया जा सकता है या फ़ील्ड डायाफ्राम के ऊपर इसके नीचे रखा जा सकता है, और विश्लेषक को रिवॉल्वर में एक स्लॉट में या एक मध्यवर्ती इंसर्ट में रखा जा सकता है।

चित्र में. चित्र 3 एक ध्रुवीकरण माइक्रोस्कोप का एक योजनाबद्ध आरेख दिखाता है। सभी प्रकाश सूक्ष्मदर्शी में सामान्य घटकों के अलावा, एक ध्रुवीकरण माइक्रोस्कोप में दो ध्रुवीकरण फिल्टर होते हैं (एक ध्रुवीकरणकर्ता, आमतौर पर कंडेनसर के नीचे स्थित होता है, और एक विश्लेषक ऐपिस में स्थित होता है), साथ ही एक कम्पेसाटर भी होता है। विश्लेषक को घूमना चाहिए, और रोटेशन की डिग्री निर्धारित करने के लिए एक उपयुक्त स्नातक पैमाने की आवश्यकता होती है।

एक ध्रुवीकरण माइक्रोस्कोप एक रोशनी स्रोत का उपयोग करता है जो प्रकाश किरण का उच्च घनत्व प्रदान करता है। ऐसे स्रोत के रूप में 12 V के वोल्टेज पर 100 W लैंप का उपयोग करने की अनुशंसा की जाती है। कुछ प्रकार के शोध के लिए, मोनोक्रोमैटिक प्रकाश की आवश्यकता होती है। इस प्रयोजन के लिए, एक धातु हस्तक्षेप फिल्टर का उपयोग किया जाता है, जिसे दर्पण के ऊपर रखना सबसे अच्छा होता है। प्रकाश बिखेरने वाला फ्रॉस्टेड ग्लास पोलराइज़र के सामने रखा जाता है, यानी। इसके और प्रकाश स्रोत के बीच, लेकिन ध्रुवीकरणकर्ता के बाद किसी भी स्थिति में नहीं, क्योंकि इससे ध्रुवीकरण फ़िल्टर का कार्य बाधित हो जाएगा।

अतीत में, आंतरिक तनाव के बिना अक्रोमैटिक उद्देश्यों का उपयोग ध्रुवीकरण माइक्रोस्कोपी के लिए किया जाता था, लेकिन ये अब दुर्लभ हैं। आज, ध्रुवीकरण सूक्ष्मदर्शी में केवल योजना अक्रोमेटिक उद्देश्यों का उपयोग किया जाता है, जिनमें आंतरिक तनाव नहीं होता है। एपोक्रोमैटिक लेंस का उपयोग केवल उन मामलों में किया जा सकता है जहां माइक्रोफोटोग्राफी के दौरान सामान्य रंग प्रतिपादन की आवश्यकता होती है।

ध्रुवीकरण सूक्ष्मदर्शी एक घूर्णन चरण से सुसज्जित होते हैं, जिसकी ऑप्टिकल अक्ष के सापेक्ष स्थिति को बदला जा सकता है। मेज के घूमने के कोण को उसकी परिधि पर अंकित डिग्री स्केल का उपयोग करके मापा जाता है। ध्रुवीकरण माइक्रोस्कोपी के प्रभावी उपयोग के लिए पूर्वापेक्षाओं में से एक है सेंटरिंग स्क्रू का उपयोग करके घूर्णन चरण का सावधानीपूर्वक संरेखण।

ध्रुवीकरण माइक्रोस्कोप का एक महत्वपूर्ण तत्व एक कम्पेसाटर है जो उद्देश्य और विश्लेषक के बीच रखा जाता है, आमतौर पर माइक्रोस्कोप ट्यूब में। कम्पेसाटर विशेष प्रकार के जिप्सम, क्वार्ट्ज या अभ्रक से बनी एक प्लेट होती है। यह आपको नैनोमीटर में व्यक्त विभाजित प्रकाश किरणों के पथ में अंतर को मापने की अनुमति देता है। कम्पेसाटर की कार्यप्रणाली प्रकाश किरणों के पथ में अंतर को बदलने, इसे शून्य तक कम करने या इसे अधिकतम तक बढ़ाने की क्षमता से सुनिश्चित होती है। यह कम्पेसाटर को ऑप्टिकल अक्ष के चारों ओर घुमाकर प्राप्त किया जाता है।

ध्रुवीकृत प्रकाश में माइक्रोस्कोपी तकनीक

अंधेरे कमरे में ध्रुवीकरण माइक्रोस्कोपी करना अधिक सुविधाजनक है, क्योंकि शोधकर्ता की आंख में प्रवेश करने वाले प्रकाश प्रवाह की तीव्रता मूल की तुलना में 2 गुना कम हो जाती है। माइक्रोस्कोप इल्यूमिनेटर चालू करने के बाद, सबसे पहले पोलराइज़र या विश्लेषक को घुमाकर दृश्य क्षेत्र की सबसे चमकदार संभव रोशनी प्राप्त करें। ध्रुवीकरण फिल्टर की यह स्थिति उनके ध्रुवीकरण के विमानों के संयोग से मेल खाती है। दवा को एक मंच पर रखा जाता है और पहले एक उज्ज्वल क्षेत्र में अध्ययन किया जाता है। फिर, पोलराइज़र (या विश्लेषक) को घुमाकर, दृश्य के क्षेत्र को जितना संभव हो उतना गहरा कर दिया जाता है; यह फ़िल्टर स्थिति ध्रुवीकरण के विमानों की लंबवत व्यवस्था से मेल खाती है। अनिसोट्रॉपी के प्रभाव को प्रकट करने के लिए, अनिसोट्रोपिक वस्तु के ध्रुवीकरण के तल को ध्रुवीकृत प्रकाश के तल के साथ जोड़ना आवश्यक है। अनुभवजन्य रूप से, यह ऑब्जेक्ट चरण को ऑप्टिकल अक्ष के चारों ओर घुमाकर प्राप्त किया जाता है। यदि एक प्रकाश माइक्रोस्कोप जो घूर्णन चरण से सुसज्जित नहीं है, का उपयोग ध्रुवीकरण माइक्रोस्कोपी के लिए किया जाता है, तो हिस्टोलॉजिकल नमूने को मैन्युअल रूप से घुमाया जाना चाहिए। यह स्वीकार्य है, लेकिन इस मामले में कुछ प्रकार के ध्रुवीकरण माइक्रोस्कोपी को अंजाम देना असंभव है जिसके लिए मात्रात्मक मूल्यांकन की आवश्यकता होती है (द्विअपवर्तन के संकेत का निर्धारण, प्रकाश किरणों के पथ में अंतर का परिमाण)।

यदि परीक्षण नमूने में अनिसोट्रोपिक वस्तुओं को व्यवस्थित तरीके से व्यवस्थित किया गया है (उदाहरण के लिए, धारीदार मांसपेशी फाइबर की अनिसोट्रोपिक डिस्क), तो चरण की एक निश्चित स्थिति में उनका अध्ययन करना सुविधाजनक है, जिसमें ये वस्तुएं एक अंधेरे पृष्ठभूमि के खिलाफ अधिकतम चमक देती हैं। . यदि अनिसोट्रोपिक संरचनाएं तैयारी में अव्यवस्थित रूप से स्थित हैं (उदाहरण के लिए, क्रिस्टल), तो उनका अध्ययन करते समय आपको वस्तुओं के एक या दूसरे समूह की चमक प्राप्त करने के लिए लगातार चरण को घुमाना होगा।

टॉपो-ऑप्टिकल प्रतिक्रियाओं का अधिक गहन विश्लेषण और मूल्यांकन करने के लिए, द्विअपवर्तन के सापेक्ष संकेत, किरणों के पथ में अंतर के परिमाण और सूचकांक (गुणांक) को निर्धारित करने की पद्धति को जानना आवश्यक है। अपवर्तन.

द्विअपवर्तन का चिह्न विश्लेषक से गुजरने वाली प्रकाश किरणों के पथ के विस्थापन की डिग्री और दिशा को दर्शाता है। यह बदलाव टोपो-ऑप्टिकल रंगों के कारण होता है, और यदि इसे किरणों के पथ में अंतर को कम करने की दिशा में निर्देशित किया जाता है, तो वे द्विअपवर्तन के नकारात्मक संकेत की बात करते हैं ( नकारात्मक अनिसोट्रॉपी), यदि यह किरणों के पथ में अंतर को बढ़ाने में मदद करता है, तो द्विअपवर्तन का एक सकारात्मक संकेत बताया गया है ( सकारात्मक अनिसोट्रॉपी). यदि किरणों के पथ में अंतर गायब हो जाता है, तो अनिसोट्रॉपी प्रभाव समाप्त हो जाता है।

द्विअपवर्तन का चिन्ह एक कम्पेसाटर का उपयोग करके निर्धारित किया जाता है। इसके उपयोग की प्रक्रिया इस प्रकार है. अध्ययन के तहत वस्तु को ऐसी स्थिति में रखा गया है, जहां दृश्य के अंधेरे क्षेत्र में अनिसोट्रोपिक संरचनाओं की अधिकतम चमक प्राप्त होती है। आरआई कम्पेसाटर प्लेट विश्लेषक के ध्रुवीकरण विमान के सापेक्ष +45° के कोण पर ऑप्टिकल अक्ष के चारों ओर घूमती है। कोई वस्तु, प्रकाश किरणों के पथ में अंतर के आधार पर, जो 20 से 200 एनएम तक हो सकती है, नीला या पीला रंग प्राप्त कर लेती है। पहले मामले में, द्विअपवर्तन का संकेत सकारात्मक है, दूसरे में - नकारात्मक। यह ध्यान में रखा जाना चाहिए कि उस स्थिति में जब कम्पेसाटर +45° के कोण पर स्थित होता है, तो देखने के अंधेरे क्षेत्र की समग्र पृष्ठभूमि में लाल रंग होता है।

एक λ/4 कम्पेसाटर (U-TP137) का भी उपयोग किया जा सकता है। इसका उपयोग करने की प्रक्रिया समान है, केवल देखने के क्षेत्र में लाल के बजाय भूरे रंग का टिंट होता है, और वस्तु अपवर्तन के सकारात्मक संकेत के साथ चमकती है, और नकारात्मक संकेत के साथ अंधेरा हो जाती है।

नैनोमीटर में व्यक्त प्रकाश किरणों के पथ में अंतर का मात्रात्मक निर्धारण, ब्रैक कोहलर कम्पेसाटर का उपयोग करके किया जाता है। ऐसा करने के लिए, सूत्र का उपयोग करें:

Γ=Γλ×sinφ

जहां λ निर्माता द्वारा कम्पेसाटर पर अंकित एक स्थिरांक है, φ विश्लेषक के ध्रुवीकरण विमान के सापेक्ष कम्पेसाटर के घूर्णन का कोण है।

अनिसोट्रोपिक वस्तु का अपवर्तनांक उसके बगल में रखी एक परीक्षण वस्तु के साथ (माइक्रोस्कोप के नीचे) तुलना करके निर्धारित किया जाता है। ज्ञात अपवर्तक सूचकांक वाले मानक तरल पदार्थ का उपयोग परीक्षण वस्तुओं के रूप में किया जाता है। वस्तु और नमूने को मंच पर एक साथ रखा जाता है। जब उनके अपवर्तक सूचकांक मेल नहीं खाते हैं, तो वस्तु और नमूने के बीच एक प्रकाश रेखा दिखाई देती है जिसे बेक लाइन कहा जाता है। माइक्रोस्कोप ट्यूब को केंद्रित स्थिति के सापेक्ष ऊपर उठाने से बेक लाइन माध्यम की ओर स्थानांतरित हो जाती है, जो अपवर्तन का अधिक स्पष्ट प्रभाव देती है। जब वस्तु और नमूने के अपवर्तक सूचकांक मेल खाते हैं, तो बेक रेखा गायब हो जाती है। आमतौर पर, अपवर्तक सूचकांक स्पेक्ट्रम की सोडियम लाइन (589 एनएम की तरंग दैर्ध्य और 20 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर) के लिए मोनोक्रोमैटिक प्रकाश में निर्धारित किया जाता है। ध्रुवीकरण के दो परस्पर लंबवत तलों के लिए अपवर्तन निर्धारित किया जाना चाहिए। इस प्रयोजन के लिए, विश्लेषक को हटा दिया जाता है और वस्तु का अपवर्तन उसकी दो परस्पर लंबवत स्थितियों में दर्ज किया जाता है। दोनों अपवर्तक सूचकांकों (एनजी - एनके) के बीच का अंतर अपवर्तन की ताकत को दर्शाता है।

सामग्री प्रसंस्करण और तैयारी की विशेषताएं

अम्लीय फॉर्मेलिन में ध्रुवीकरण माइक्रोस्कोपी के लिए सामग्री को ठीक करना अवांछनीय है, क्योंकि अम्लीय फॉर्मेल्डिहाइड के साथ ऊतक हीमोग्लोबिन की बातचीत से बनने वाले फॉर्मेलिन वर्णक में अनिसोट्रोपिक गुण होते हैं और ध्रुवीकृत प्रकाश में तैयारी का अध्ययन करना मुश्किल हो जाता है। जी. शेयूनर और जे. हट्सचेनरेइटर (1972) इस उद्देश्य के लिए 10% तटस्थ फॉर्मेलिन, बेकर के कैल्शियम-फॉर्मोल समाधान और कार्नॉय के तरल का उपयोग करने की सलाह देते हैं।

10% तटस्थ फॉर्मेलिन में निर्धारण की अवधि 4 डिग्री सेल्सियस पर 24 - 72 घंटे है, बेकर के कैल्शियम-फॉर्मोल समाधान में - 4 डिग्री सेल्सियस पर 16 - 24 घंटे। लिपिड-प्रोटीन यौगिकों का अध्ययन करते समय कैल्शियम-फॉर्मोल में निर्धारण को विशेष रूप से प्राथमिकता दी जाती है। कार्नॉय का तरल कपड़ों को जल्दी से संतृप्त करता है। 1 - 2 मिमी की मोटाई वाले टुकड़ों को 4 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर केवल 1 घंटे के बाद प्रोफाइल किया जा सकता है। कार्नॉय के द्रव में निर्धारण लिपिड अध्ययन के लिए उपयुक्त नहीं है। इसके अलावा, ज़ेंकर के तरल का उपयोग किया जाता है, खासकर जब सोने और चांदी के नमक के साथ संसेचन किया जाता है। ज़ेंकर के तरल और एसिटिक एसिड के मिश्रण से उपचार के बाद, लाल रक्त कोशिकाएं द्विअपवर्तन से गुजरने की क्षमता प्राप्त कर लेती हैं।

ध्रुवीकरण माइक्रोस्कोप में घने ऊतकों (हड्डियों, दांतों) की जांच करते समय, एसिड डीकैल्सीफिकेशन के अलावा, कोलेजन फाइबर को हटाने के लिए अतिरिक्त प्रसंस्करण की आवश्यकता होती है। इस प्रयोजन के लिए, ऐसे ऊतकों के खंडों को ग्लिसरीन और पोटेशियम हाइड्रॉक्साइड (10 मिलीलीटर ग्लिसरीन और पोटेशियम हाइड्रॉक्साइड के 2 दाने) के मिश्रण में कई मिनट तक उबाला जाता है जब तक कि वे पूरी तरह से सफेद न हो जाएं, फिर क्षार को सावधानीपूर्वक सूखा दिया जाता है, खंड को पानी में धोया जाता है और चिमटी की मदद से माइक्रोस्कोप चरण में स्थानांतरित कर दिया गया।

ध्रुवीकरण माइक्रोस्कोपी के लिए, पैराफिन, फ्रोजन और क्रायोस्टेट अनुभागों का उपयोग किया जाता है। ध्रुवीकृत प्रकाश के तहत जांच के लिए बिना दाग वाले जमे हुए खंडों को ग्लिसरॉल में एम्बेडेड किया जाता है। तैयारी के तुरंत बाद ध्रुवीकरण सूक्ष्म विश्लेषण के लिए अनफिक्स्ड क्रायोस्टेट अनुभाग उपयुक्त हैं। विभिन्न पर्यावरणीय कारकों के हानिकारक प्रभावों के प्रति उनकी उच्च संवेदनशीलता के कारण, इन वर्गों को अभी भी 10% तटस्थ फॉर्मेल्डिहाइड या कैल्शियम-फॉर्मोल समाधान में तय करने की सिफारिश की जाती है।

ध्रुवीकरण माइक्रोस्कोपी के परिणाम हिस्टोलॉजिकल अनुभागों की मोटाई से प्रभावित होते हैं। मोटे वर्गों का अध्ययन करते समय, एक दूसरे के ऊपर विभिन्न अनिसोट्रोपिक संरचनाओं के सुपरपोजिशन के लिए स्थितियाँ बनाई जाती हैं। इसके अलावा, अलग-अलग स्लाइस मोटाई के साथ, अध्ययन की जा रही संरचनाओं के अनिसोट्रोपिक गुण बदल सकते हैं, इसलिए यह बहुत महत्वपूर्ण है, विशेष रूप से तुलनात्मक अध्ययन में, निरंतर स्लाइस मोटाई सुनिश्चित करने के लिए। अनुशंसित अधिकतम अनुभाग मोटाई 10 µm से अधिक नहीं होनी चाहिए।

एक अन्य अनिवार्य शर्त अनुभागों की सावधानीपूर्वक डीवैक्सिंग है, क्योंकि हटाए गए पैराफिन अवशेष एक स्पष्ट अनिसोट्रॉपी प्रभाव देते हैं, जिससे अध्ययन जटिल हो जाता है। पैराफिन विशेष रूप से लाल रक्त कोशिकाओं और कोशिका नाभिक पर लंबे समय तक रहता है। अनुभागों से पैराफिन को पूरी तरह से हटाने के लिए, निम्नलिखित प्रसंस्करण करने की अनुशंसा की जाती है।

• ज़ाइलीन 30 मि
• अल्कोहल 100% 5 मिनट
• 24 घंटे के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर मेथनॉल और क्लोरोफॉर्म (1:1) का मिश्रण
• अल्कोहल 100% 5 मिनट
• अल्कोहल 70% 10 मिनट पानी

यह भी ध्यान में रखा जाना चाहिए कि जो अनुभाग ध्रुवीकरण माइक्रोस्कोपी के अधीन हैं, उन्हें फिनोल के संपर्क में नहीं आना चाहिए (उदाहरण के लिए, उन्हें कार्बोलिक जाइलीन में साफ नहीं किया जाना चाहिए)।

ध्रुवीकरण माइक्रोस्कोपी और कम्पेसाटर के उपयोग पर अधिक विस्तृत जानकारी लिंक (http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/polarized/polarizedhome.html) से प्राप्त की जा सकती है।

यदि ध्रुवीकरण माइक्रोस्कोपी के बारे में आपके कोई प्रश्न हैं, तो कृपया माइक्रोस्कोपी स्कूल से संपर्क करें।

माइक्रोस्कोपी के लिए सभी प्रकार के उपकरणों में से, ध्रुवीकरण माइक्रोस्कोप तकनीकी रूप से सबसे जटिल हैं। विनिर्माण क्षमता के संदर्भ में डिवाइस के डिज़ाइन पर इतना ध्यान उच्चतम गुणवत्ता की छवियों को प्राप्त करने की आवश्यकता के कारण है, जो सीधे माइक्रोस्कोप के ऑप्टिकल और प्रकाश भागों के डिजाइन से प्रभावित होते हैं। माइक्रोस्कोपी के लिए ध्रुवीकरण उपकरणों के उपयोग का मुख्य क्षेत्र खनिजों, क्रिस्टल, स्लैग, अनिसोट्रोपिक वस्तुओं, कपड़ा और दुर्दम्य उत्पादों के साथ-साथ अन्य सामग्रियों का अध्ययन है जो द्विअपवर्तन की विशेषता रखते हैं। बाद वाले सिद्धांत का उपयोग माइक्रोस्कोपी उपकरणों में छवियां बनाने के लिए किया जाता है जिसमें अध्ययन के तहत नमूना ध्रुवीकरण किरणों से विकिरणित होता है। इस मामले में, नमूनों के अनिसोट्रोपिक गुण किरण की दिशा बदलने के बाद दिखाई देते हैं। इन उद्देश्यों के लिए, ध्रुवीकरण सूक्ष्मदर्शी के डिज़ाइन में एक दूसरे के सापेक्ष विभिन्न विमानों में घूमने वाले फ़ील्ड फ़िल्टर शामिल होते हैं: विश्लेषक 180 डिग्री घूमता है, और ध्रुवीकरणकर्ता 360 डिग्री घूमता है। ध्रुवीकृत प्रकाश में माइक्रोस्कोपी के लिए उपकरणों की मुख्य विशेषता ऑर्थोस्कोपिक संचालन करने की क्षमता है और कोनोस्कोपिक अध्ययन, जो अधिकांश अन्य प्रकार के सूक्ष्मदर्शी के साथ उपलब्ध नहीं हैं।

ध्रुवीकरण माइक्रोस्कोप के तहत एक नमूने का अध्ययन एपर्चर डायाफ्राम के बगल में, कंडेनसर के नीचे माइक्रोस्कोप के रोशनी वाले हिस्से में एक ध्रुवीकरण स्थापित करने से शुरू होता है। इस मामले में, विश्लेषक ऐपिस और लेंस के बीच स्थित होता है - प्रकाश किरणों के पथ के साथ लेंस के पीछे। माइक्रोस्कोपी के लिए ऐसे उपकरण के सही सेटअप के साथ, फ़िल्टर फ़ील्ड को पार करने के बाद, दृश्य क्षेत्र समान रूप से अंधेरा हो जाएगा, जिससे तथाकथित विलुप्त होने का प्रभाव पैदा होगा। डिवाइस सेटिंग्स के पूरा होने पर, अध्ययन के तहत नमूना मंच पर तय किया जाता है और अध्ययन किया जाता है। ध्रुवीकरण सूक्ष्मदर्शी की तालिकाएँ ऑप्टिकल अक्ष के सापेक्ष केंद्रित होती हैं और इन्हें 360 डिग्री घुमाया जा सकता है, और प्रयोगशाला और अनुसंधान उद्देश्यों के लिए समान उपकरणों में उनके पास एक वर्नियर भी होता है। ध्रुवीकरण सूक्ष्मदर्शी की प्रकाशिकी और प्रकाश व्यवस्था उच्चतम गुणवत्ता और ऐसी विनिर्माण सटीकता की है जो आपको विरूपण के बिना सबसे स्पष्ट छवि प्राप्त करने की अनुमति देती है। अक्सर, ध्रुवीकृत प्रकाश में नमूनों का अध्ययन करने के लिए उपकरणों के सेट में एक कम्पेसाटर और एक बर्ट्रेंड लेंस शामिल होता है। पहला खनिजों की संरचना का प्रभावी ढंग से अध्ययन करना संभव बनाता है, और जब चरण घूमने के बाद छवि में परिवर्तन होता है तो लेंस आपको अवलोकन क्षेत्र को बड़ा करने और ध्यान केंद्रित करने की अनुमति देता है। आज बाजार में माइक्रोस्कोपी के लिए तीन मुख्य प्रकार के ऐसे उपकरण हैं - पहले से ही उल्लेखित अनुसंधान और प्रयोगशाला माइक्रोस्कोप, साथ ही एक कार्यशील ध्रुवीकरण माइक्रोस्कोप।

ध्रुवीकरण माइक्रोस्कोपी

ध्रुवीकरण माइक्रोस्कोपी आपको परस्पर लंबवत विमानों में ध्रुवीकृत दो बीमों द्वारा गठित प्रकाश में अध्ययन की वस्तुओं का अध्ययन करने की अनुमति देता है, अर्थात, ध्रुवीकृत प्रकाश में। ऐसा करने के लिए, फिल्म पोलेरॉइड्स या निकोलस प्रिज्म का उपयोग किया जाता है, जिन्हें प्रकाश स्रोत और तैयारी के बीच एक माइक्रोस्कोप में रखा जाता है। ध्रुवीकरण तब बदलता है जब प्रकाश किरणें कोशिकाओं और ऊतकों के विभिन्न संरचनात्मक घटकों से गुजरती हैं, जिनके गुण विषम होते हैं, या जब उनसे परावर्तित होती हैं।

ऑप्टिकली आइसोट्रोपिक संरचनाओं में, ध्रुवीकृत प्रकाश के प्रसार की गति ध्रुवीकरण के तल पर निर्भर नहीं होती है; अनिसोट्रोपिक संरचनाओं में, यह वस्तु के अनुदैर्ध्य या अनुप्रस्थ अक्ष के साथ प्रकाश की दिशा के आधार पर बदलती है। यदि संरचना के साथ प्रकाश का अपवर्तनांक अनुप्रस्थ दिशा से अधिक है, तो सकारात्मक द्विअपवर्तन होता है; यदि संबंध उलट जाता है, तो नकारात्मक द्विअपवर्तन होता है। कई जैविक वस्तुओं में मजबूत आणविक अभिविन्यास होते हैं, अनिसोट्रोपिक होते हैं, और प्रकाश की सकारात्मक द्विअपवर्तन का कारण बनते हैं।

डार्क-फील्ड माइक्रोस्कोपी

डार्क-फील्ड माइक्रोस्कोपी में, नमूने को किरणों की तिरछी किरणों द्वारा किनारे से रोशन किया जाता है जो लेंस में प्रवेश नहीं करती हैं। केवल वे किरणें जो दवा के कणों द्वारा परावर्तन, अपवर्तन या विवर्तन के परिणामस्वरूप विक्षेपित हो जाती हैं, लेंस में प्रवेश करती हैं। इस वजह से, माइक्रोबियल कोशिकाएं और अन्य कण काली पृष्ठभूमि पर चमकते हुए दिखाई देते हैं (चित्र टिमटिमाते तारों वाले आकाश जैसा दिखता है)।

डार्क-फील्ड माइक्रोस्कोपी के लिए, एक विशेष कंडेनसर (पैराबोलॉइड कंडेनसर या कार्डियोइड कंडेनसर) और पारंपरिक उद्देश्यों का उपयोग किया जाता है। चूंकि विसर्जन उद्देश्य का एपर्चर डार्क-फील्ड कंडेनसर के एपर्चर से बड़ा है, इसलिए इसके एपर्चर को कम करने के लिए विसर्जन उद्देश्य के अंदर एक विशेष ट्यूबलर डायाफ्राम डाला जाता है।